摘要：以广西黄连山自然保护区内的德保苏铁幼苗为材料，研究了不同叶数苏铁幼苗叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性以及丙二醛(MDA)、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白质含量的变化。
结果表明：在7月至11月间，随着时间的推移，德保苏铁幼苗叶片的SOD、POD活性均呈递增趋势，CAT活性则先缓慢下降后又呈递增的趋势；MDA含量呈下降趋势；脯氨酸含量呈缓慢上升趋势；可溶性糖和可溶性蛋白质均呈持续积累趋势。综合分析结果表明：可将不同叶数苏铁幼苗分为两类：5叶植株单独为一类，环境适应能力强；3叶植株和4叶植株可聚为一类，环境适应能力相对较强。
关键词：德保苏铁；回归引种；保护酶活性；脯氨酸；可溶性糖
德保苏铁（Cycas debaoensis）是我国西南地区特有的苏铁种类，属国家一级保护植物。由于生境破坏，目前野生植株较少，据IUCN等级，属濒危物种。珍稀濒危植物的保护有三种常用方式：就地保护、迁地保护和回归引种。就地保护是在受保护物种的原产地进行保护。迁地保护是指将受保护物种的部分或全部植株迁移到其他地区进行保护。一些植物园除了潘植物收集圃之外，还建立了田间基因库、种子库、离体保存库等设施，成为进行植物迁地保护的主要机构。回归引种是将濒危植物重新定植于该物种原有的自然分布区及相同或相似的生境内，通过采取一定的人工辅助措施，使其最终成为或强化为可长期成活的、自行维持下去的居群( Kier-stead，1987)。由于绝大多数的物种是因为生境地丧失或遭破坏而成为珍稀濒危物种的，对于这些物种来说，回归引种是拯救该物种的极为有效的方法(Griffith，1989)，被认为是连接就地保护和迁地保护的桥梁（陈灵芝等，2001），是生态保护的一个重要组成部分，也是迁地保护的稀有、濒危植物的最终归宿(Maunder，1992)，所以这些年来国际上已有不少研究机构从事这个新领域的研究。
2002年，深圳仙湖植物园担当起德保苏铁迁地保护研究任务。2007年11月，国家林业局启动德保苏铁回归自然项目。2008年4月，由深圳市仙湖植物园“国家苏铁种质资源保护中心”播种繁育的500株德保苏铁实生苗被回归种植到广西黄连山自然保护区。根据回归后两年的跟踪调查表明，回归种群生长良好，发叶率达94%，根系发育良好，并伴有大量的珊瑚根。但由于回归种植在热带季风气候区，在平均气温25.6c，最冷月平均气温11.4℃，历年极端最高气温37.2℃，历年极端最低气温-2.6℃。雨量充沛，分布不均，年总降雨量1 473.9 mm；其中5～10月降雨量1 220.9 mm，占全年降雨量的82. 8%。全年日照1 475.O h，占可照时数的30%。
该区是典型的峰林谷地地貌，属石灰岩地带。毗邻德保苏铁的模式产地——德保县扶平镇上坪地，因此生态环境与德保苏铁的模式产地极为相似。表1为回归地与原生地土壤的基本情况。
1.2供试材料
种植密度为每亩约40株，共500株。经过调查，发现全部苗木在叶长、叶宽、羽叶数等这些形态性状上没有明显的差异，变异幅度小；但是，各植株的叶片数却明显表现为3叶或4叶或5叶。由于苏铁叶片生长比较缓慢，因此，对保护区内回归的全部苗木，根据叶片数，划分为3叶植株、4叶植株和5每年的7月至11月间，随着气温升高、秋季天气逐渐干燥，德保苏铁对外界环境变化的反应如何，是否具有抵抗胁迫环境的能力等，目前均不见报道。从保育地到回归地的过程中，由于生境的改变，对回归植物的生理生态产生了影响，不同叶数的植株对回归环境有何适应，也不得而知。因此，本文分别于2010年7月、9月、11月对广西簧连山自然保护区内的回归苗进行了系统的调查，拟从植物生理响应的角度，研究不同叶数的德保苏铁到回归地后的生理生态响应，为德保苏铁回归保护提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1研究区概况
广西黄连山自然保护区位于广西壮族自治区德保县境内，由黄连山片和兴旺片组成，引种地点为原黄连山林场老场部前后山坡，海拔为850～900 m，106。14' E，23。33'N。属热带季风气候，夏季闷热多雨，秋季昼夜温差大，冬季低温干燥，春季回暖旱频；无霜期长，雨量充沛，光照充足，热量丰富；但灾害性天气出现频繁。年平均气温为19.5℃，最热月叶植株这三种类型。
1.3样品采集与测定方法
每种类型选取优势植株各五株采其当年生叶片，所取叶片先用液氮冷处理后装入带冰块的保温箱中运回，置于-20。C冰箱保存以备测定。超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法(汤章城，1999)。过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的测定采用分光光度计法；丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法(张志良，2003)。脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法（邹琦，2203）；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法（李舍生等，2000）；可溶性蛋白质含量考马斯亮蓝比色法(汤章城，1999)。
1.4数据处理
所有数据均用Exce12003计算处理，采用SPSS软件进行分析，采用单因素方差分析( one-wayANOVA)比较不同数据组间的差异。
2 结果与分析
2.1叶片SOD活性的变化
德保苏铁体内的SOD活性呈递增趋势（图1），但各级植株间递增的速率明显不同。3叶植株、4叶植株和5叶植株的SOD活性在9月份急剧上升，比7月份分别上升358. 4%、855. 2%、450. 5%;到了11月份还继续上升，分别比9月份上升了236. 1%、362. 89%和386. 1%。
2.2叶片CAT活性的变化
由图2可知，CAT活性呈递增趋势，各级植株间递增的速率也明显不同。3叶植株、4叶植株和5叶植株的CAT活性在9月份出现了缓慢下降趋势，比7月份分别下降了3. 0%、29. 0%和26. 3%，而到了11月份却明显回升，分别比7月份上升了244. 8%、308. 0%和154. 1%；其中，4叶植株CAT活性下降和上升的速度都明显大于其它植株。2.3叶片POD活性的变化
由图3可见，POD活性也呈递增趋势。POD活性在各植株间差异极显著(P<0.01)，均表现为3叶植株>4叶植株>5叶植株，7月到9月上升幅度不大，分别为35. 8%、23. 7%和17. 3%，但9月到11月却上升了98. 1%、155. 5%和205.5%。
2.4叶片MDA舍量的变化
从图4可看出，各级植株的MDA含量有明显差异，均表现为4叶植株<5叶植株<3叶植株；MDA含量总体呈下降趋势，7月到9月的下降速率分别为6.5%、15. 4%和11. 8%，9月到11月下降了53. 5%、59. 1%和56.7%；4叶植株MDA含量的下降速度比较大。可见，4叶植株细胞膜脂过氧化作用比较弱，膜损伤不大，表现出较强的抗逆性。
2.5叶片脯氨酸含量的变化
从图5可看出，在7月份，各级植株脯氨酸含量差异显著；但在9月和11月差异不明显。3叶植株、4叶植株和5叶植株脯氨酸含量呈缓慢上升趋势，7月到9月分别上升了18. 2%、26. 3%和30. 6%;9月到11月上升幅度却不大，分别为3. 8%、6.3%和4.3%。
2.6叶片可溶性糖量的变化
由图6可以看出，各植株叶片可溶性糖表现为5叶植株>4叶植株>3叶植株，这与其生物生长相似。其可溶性糖呈持续积累趋势。11月与7月相比，3叶、4叶、5叶植株的增长速度分别是43. 4%、40. 0%、32. 5%，表现为3叶植株>4叶植株>5叶植株；说明可溶性糖含量发生显著变化，植株叶片越少，易受外部环境影响。
2.7叶片可溶性蛋白质含量的变化
图7中，各植株叶片可溶性蛋白质含量表现为5叶植株>4叶植株>3叶植株，这也与其生物生长相似。可溶性蛋白质也均呈积累趋势。9月与7月相比，3叶、4叶、5叶植株的增长速度分别20. 0%、20. 8%、21. 4%;11月与7月相比，增长速度分别是30. 0%、33.3%、35.3%；均表现为5叶植株>4叶植株>3叶植株，这与其含量变化相似，说明蛋白质含量相对稳定。
CASE 0 5 10 15 20 25
3叶植株1——
4叶植株2———
5叶植株3-
图8各材料生理指标综合聚类图
Fig.8 Comprehensive clustering of characters
2.8坐存能力综合评价
综合各项生理指标的月变量，将3种不同叶数苏铁幼苗进行聚类分析，图8结果表明，不同叶数苏铁幼苗可分为两类。其中5叶植株单独为一类，其各项生理指标总体变化稳定，环境适应能力强；3叶植株和4叶植株可聚为一类，其各项生理指标总体变化相对稳定，环境适应能力相对较强。
3 结论与讨论
3.1植物生长与抗氧化酶活性的关系
植物在逆境条件下产生的活性氧自由基(ROS)会破坏植物体内的细胞膜以及蛋白质等大分子物质(Schimint，1967)，从而影响到植物的正常生长与发育。同时在逆境条件下植物体内的保护酶系统，即抗氧化酶系统，主要包括SOD、CAT、POD，能够消除体内多余的自由基（张继澍，2006）。这些酶联系着植物的生长和生理特性，在一定的逆境胁迫下，抗氧化酶活性的高低被认为植物自我保护能力的大小(Senaratna等，1985)。在7月至11月间，德保苏铁幼苗叶片的抗氧化酶活性总体表现出递增的趋势，这有可能是由于植株体内活性氧的增加引起的；但各植株间存在很大差异，表现为：(1)3叶植株、4叶植株和5叶植株的SOD活性大小各不一致；(2)3叶植株的CAT活性显著或极显著大于4叶植株或5叶植株；(3)POD活性均极显著表现为3叶植株>4叶植株>5叶植株。可见，为清除多余的活性氧，各植株的SOD、POD和CAT活性上升，从而维持活性氧代谢平衡，保护细胞膜结构，使植物具有抵抗胁迫环境的能力。
3.2膜脂过氧化作用与抗氧化酶活性的关系
植物在逆境胁迫下，往往发生膜脂过氧化作用而产生丙二醛(MDA)，此产物通常被作为膜脂过氧化指标。在7月至11月间，德保苏铁幼苗叶片的MDA含量各植株间极显著表现为4叶植株<5叶植株<3叶植株；这与其生物生长不一致。有关研究表明抗氧化酶活性与MDA含量紧密相联，抗氧化酶活性高则MDA含量低（徐东生等，2007），这在德保苏铁幼苗上也得到证实。MDA是膜脂过氧化作用的最终产物，MDA含量呈下降趋势，推测较高的抗氧化酶活性能够抑制膜脂过氧化作用，从而使MDA含量保持在较低水平。
3.3植物抗逆性与脯氨酸含量的关系
当植物处于高温等逆境胁迫下，脯氨酸含量上升(赵福庚等，1999)。脯氨酸含量上升是植物适应胁迫环境的表现，其积累指数与植物的抗逆性有关，脯氨酸含量上升幅度大则抗逆性强。本研究表明，虽然德保苏铁幼苗的腩氨酸含量在各植株间差异不明显，但在7月至11月间也呈现出缓慢上升趋势，可认为德保苏铁幼苗处在一个相对良好的环境中，没有受逆境胁迫，或者受轻微胁迫但不影响植株正常生长。
3.4可溶性糖与可溶性蛋白质的关系
植物体内可溶性糖和可溶性蛋白质密切相关，可溶性糖的大量积累，促使细胞渗透势下降，从外界继续吸水，这样可以保持蛋白质的水合度，防止原生质脱水，使植物体内各种代谢过程正常进行（赵志刚等，2005）。本研究表明，德保苏铁幼苗可溶性糖和可溶性蛋白质含量在7月至11月间均呈递增趋势，且显著表现为5叶植株>4叶植株>3叶植株，这与其生物生长相似。
在7～11月，随着时间的推移，德保苏铁各植株体内的SOD、POD活性均呈递增趋势，CAT活性则先缓慢下降后又呈递增的趋势；MDA含量呈下降趋势；脯氨酸含量呈缓慢上升趋势；叶片可溶性糖和可溶性蛋白质均呈持续积累趋势。通过聚类分析可将不同叶数苏铁幼苗分为两类：5叶植株单独为一类，环境适应能力强；3叶植株和4叶植株可聚为一类，环境适应能力相对较强。
本研究从回归植物的生理生态方面进行比较，可看出：从深圳仙湖植物园回归引种到广西黄连山自然保护区后，德保苏铁幼苗的生长状现都表现良好；其中，3叶植株和4叶植株差别不明显，5叶植株的环境适应性略优。
由于珍稀濒危物种的回归是一个非常漫长的过程，而评价回归是否成功的一个最起码的标准是从种子到种子，即回归的植物能在自然生境中正常生长、发育，能够产生有生命力的种子；因此，本研究可作为德保苏铁回归效果评价的一个重要依据。
