棉花黄萎病拮抗真菌的筛选鉴定及其室内盆栽防效

棉花黄萎病拮抗真菌的筛选鉴定及其室内盆栽防效

 

摘　要：　从南疆阿拉尔新疆生产建设兵团１６团和北疆沙湾新疆生产建设兵团１４４团连作１０年以上且黄萎病发病严重的棉田采集２４份棉花根际土，采用稀释平板法和平板对峙法对土样进行分离、筛选拮抗真菌。从中筛选出一株对棉花黄萎 病 有 较 强 拮 抗 作 用 的 真 菌 菌 株，编 号 为 ＮＪＺ１２－２。抑 菌 试 验 和 室 内 盆 栽 防 效 试 验 结 果 表 明，ＮＪＺ１２－２菌株对棉花黄萎病菌的抑菌率为５８．６７％，室内盆栽防治效果为５２．４１％～５４．８１％。并通过 ＰＣＲ 扩增该拮抗菌株的ＩＴＳ基因序列，在 ＮＣＢＩ中进行同源性比较，用 ＭＥＧＡ５．０构建系统发育树并结合形态学特征及生理生化指标，最终将菌株鉴定为 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐ．。

 

　棉花黄萎病是由半知菌亚门丛梗孢目轮枝菌属大丽轮枝 菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄａｈｌｉａｅ　Ｋｌｅｂ）引起的维管束土传病害，具有寄主范围广、变异性强、有较强抗逆性等特点［１］，这也是黄萎病发病猖獗的主要原因。目前，防治棉花黄萎病方面主要采用化学防治、选育抗病品种为主，农业防治为辅，但成果收效甚微［２－４］。利用生物防治黄萎病已成为研究热点［５］。拮抗菌大多存在于植物的根系和叶围，与植物有着棉花黄萎病是由半知菌亚门丛梗孢目轮枝菌属大丽轮枝 菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄａｈｌｉａｅ　Ｋｌｅｂ）引起的维管束土传病害，具有寄主范围广、变异性强、有较强抗逆性等特点［１］，这也是黄萎病发病猖獗的主要原因。

目前，防治棉花黄萎病方面主要采用化学防治、选育抗病品种为主，农业防治为辅，但成果收效甚微［２－４］。利用生物防治黄萎病已成为研究热点［５］。拮抗菌大多存在于植物的根系和叶围，与植物有着很好的 亲 合 性，易 于 在 作 物 上 定 植，生 防 效 果 稳定［６］。拮抗菌分泌次级代谢产物，通过直接或间接的方式，达到阻碍或杀死病原菌的效果。ＩＴＳ区段被广泛应用于真菌种群之间和种间分类学鉴定［７］。Ｗｈｉｔｅ等设计的ＩＴＳ１ 和ＩＴＳ４ 特异引物在真菌鉴定上具有快速、精准等优势［８－１１］。

通过 ＧｅｎＢａｎｋ数据库同源性比对，能提高真菌分类鉴定的准确性及效率，这为真菌分类鉴定提供了丰富的生物信息资源［１２－１５］。通过 对 南 疆 阿 拉 尔 新 疆 生 产 建 设 兵 团１６团和 北 疆 沙 湾 新 疆 生 产 建 设 兵 团 １４４ 团 连 作１０年以上且黄萎病发病严重的棉田采集根际土进行分离、筛选，结合形态学观察对筛选出的拮抗菌进行分类鉴定。并进一步通过抑菌试验及室内盆栽防效试验进行生防潜力评价，为棉花黄萎病生防菌剂的研制及开发奠定基础。

 

１　材料与方法

 

１．１　材 料

 

１．１．１　供试样品

 

２０１７年，在棉花苗期（５月２１日）、现蕾期（６月２４日）、花龄期（７月１２日），从南疆阿拉尔新疆生产建设兵 团 １６ 团 和 北 疆 沙 湾 新 疆 生 产 建 设 兵 团１４４团连作１０年以上且黄萎病发病严重的新疆农业大学农学院试验田中各随机选取４株长势良好的植株［１６－１８］，采用５ 点取样法，取深度为 １５～２０ｃｍ棉花根际土，采集 ２４ 份土样。将土样装入保鲜袋内，注明采集土样时间、地点等，放置４℃冰箱保存。

 

 

供试病原菌：大丽轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄａｈｌｉ－ａｅ）Ｖ９９１，属于高致病力落叶型菌株［１９］，由新疆农业大学农学院微生物实验室提供。

供试棉花品种：‘中棉４４号’为高抗枯萎病、耐黄萎病品种，由新疆农业大学农学院保藏。

 

１．１．２　试剂与仪器

 

培养基：ＰＤＢ培养基配制参照赵丽坤［２０］方法。

 

试剂：Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、ｄｄ　Ｈ２Ｏ、１０×ｂｕｆｆｅｒ购于生工生物工程（上海）股份有限公司。正向引物ＩＴＳ１：（５′－ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ－３′） 和反 向 引 物 ＩＴＳ４：（５′－ＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＧ－ＧＴＣＣＡＧ－３′），由上海华大基因科技有限公司合成。Ｅａｓｙ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ试剂盒、切胶回收试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

 

仪器：电 泳 仪 （北 京 六 一 ＤＹＹ－６Ｄ 型）、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ　ＥＰ凝胶成像系统、ＰＣＲ 梯度仪（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ?ｐｒｏ）、离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１８ Ｒ）、超 净 工 作 台 （Ｂｏｘｕｎ）、压 力 灭 菌 锅。

 

１．２　方 法

 

１．２．１　土壤真菌的分离与纯化

 

参照方中达等［２１］方法，采用稀释平板法进行土样分离。称取１０ｇ土样融于９０ｍＬ无菌水中，置于摇床１６０ｒ／ｍｉｎ振荡３０ｍｉｎ后，静置５ ｍｉｎ。然后对土壤悬液进行梯度稀释，用移液枪将稀释梯度为１×１０－３、１×１０－４、１×１０－５的 土 壤 悬 液 吸 取０．１ｍＬ，接种于 ＰＤＡ 培养基上，用无菌玻璃涂布棒涂布均匀，３次重复，２８ ℃恒温培养２～３ｄ，待菌丝长出，挑取形态、颜色不同的单菌落接种至新的培养基。２～３次单胞分离后，置于４ ℃冰箱保存。

 

１．２．２　拮抗真菌的初筛及复筛

 

参照周建云［２２］等方法，采用平板对峙法进行拮抗真 菌 的 筛 选。 用 无 菌 打 孔 器 （Φ ＝７ ｍｍ）在Ｖ９９１菌落边缘打菌饼［２６］，置于 ＰＤＡ 培养基中央。用接种环挑取分离土样获得的真菌菌丝，在距菌饼２ｃｍ 的位置进行接种，分别画３条长３ｃｍ 且两两垂直的直线，２８ ℃恒温培养１５ｄ，设置对照组为不接种土壤真菌，每种菌重复３次，用游标卡尺测量抑菌圈的直径。

 

１．２．３　拮抗菌 ＮＪＺ１２－２对棉花黄萎病菌丝生长的影响

 

将拮 抗 菌 ＮＪＺ１２－２ 菌 丝 接 种 于 ＰＤＡ 培 养 基上，２８ ℃恒温培养７ｄ，用无菌打孔器 （Φ ＝７ｍｍ）制成菌饼［２６］，挑取 ３～４ 块菌饼置于 ２５０ ｍＬ　ＰＤＢ培养基中，在摇床中２８ ℃，１６０ｒ／ｍｉｎ震荡４８ｈ后，１２　０００ｒ／ｍｉｎ 离心２０ｍｉｎ，吸取上清液于灭菌离心管，１０倍稀释分装，放置４ ℃冰箱保存。

用无菌打孔器 （Φ ＝７ ｍｍ）将病原菌 Ｖ９９１制成菌饼，将菌饼置于稀释过的拮抗菌菌悬液中浸泡３０ｍｉｎ，取出晾干，置于 ＰＤＡ 培养基中央，２８ ℃恒温培养１５ｄ。用十字交叉法测量菌落直径［２３］。设置对照组为无菌水处理，重复３次［２４］。

 

生长抑制率（％）＝ 〔Ｄ０－ Ｄｃ／（Ｄ０－ ７ ）〕×１００％

 

式中：Ｄ０为对照菌落直径；Ｄｃ为处理菌落直径。

 

１．２．４　拮抗菌株 ＮＪＺ１２－２形态学观察

 

ＮＪＺ１２－２株 菌 落 边 缘 用 无 菌 打 孔 器 （Φ ＝７ｍｍ）打菌饼，并转接至新培养基上，２６ ℃恒温培养７ｄ后，肉眼观察菌落形态特征。采用插片培养法做临时玻片，光学显微镜观察菌体特征，依据菌落特征、分生孢子梗、分生孢子等特征并参照《真菌鉴定手册》［２５］对菌株初步鉴定。

 

１．２．５　拮抗菌株 ＮＪＺ１２－２的ＩＴＳ序列扩增

 

参照 Ｅａｓｙ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ试剂盒说明书提取菌株 ＮＪＺ１２－２基因组 ＤＮＡ，采用真菌通用引物ＩＴＳ１、ＩＴＳ４ 序 列 对 菌 株 的 ＩＴＳ 序 列 进 行 ＰＣＲ 扩增。２５μＬ 反 应 体 系：２ × ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ１２．５μＬ；ＤＮＡ 模板２μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ的引物ＩＴＳ１、ＩＴＳ４各１．０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　８．５μＬ。反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ、５６℃退火３０ｓ、７２℃延伸１ｍｉｎ，共３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃终止反应。 配 制 浓 度 为 ０．８％ 的 琼 脂 糖 凝 胶，在 恒 压１５０Ｖ，电泳４０ ｍｉｎ。用 切 胶 回 收 试 剂 盒 对 样 品 做ＤＮＡ 回收操作，样品送上海华大有限公司测序。