摘要：以木芙蓉叶片为研究对象，通过测定不同处理条件下相对电导率的变化，探究了木芙蓉对低温胁迫的响应机制。利用Logistic方程建立回归模型，并据此计算低温半致死温度（LT50）。结果表明，不同处理后木芙蓉叶片的相对电导率变化明显，范围为8.37%~77.92%。0℃以上的冷害胁迫对木芙蓉叶片细胞的损害较轻，而0℃以下的冻害胁迫则对其造成严重伤害。通过Logistic方程分析，处理时长为3d时，LT50为-12.14℃；处理时长为7d时，LT50为-2.29℃。双因素方差分析进一步表明，主因子（温度和时长）及交互因子均对木芙蓉叶片的相对电导率具有显著影响。旨在为木芙蓉的引种提供理论依据，为揭示其耐寒机制提供新的视角。
在自然环境中，气温是决定植物能否良好生长的关键因素之一，它直接作用于植物的发育和成长过程。而其中，低温危害是影响植物地理分布的重要因素之一[1]，大量研究表明，低温逆境胁迫对植物自身生长发育及生理生化过程影响较大，包括种子萌发、苗期生长、根系发育、保护酶系统以及光合作用等[2]。植物细胞膜的透变性如今已被视为评估其抗寒能力的显著信号之一。通过测定电解质渗出率，可以有效判断植物细胞膜的损伤水平。经过研究发现，在遭遇低温压力的情况下，植物细胞的膜结构会受到破坏，其透水性会相应增强，导致电解质向外渗出。因此，对受到低温损害的植物开展电导率测试，能够揭示细胞膜的损伤水平，从而评估其耐寒性[3-4]。通过检测植物组织在低温压力下的电导率波动，可以观察到细胞膜透水性的改变，这对于评价植物的耐寒能力具有重要意义。采用相对电导率以及Logistic方程来计算拐点温度，可以较为精确地预测出植物组织在低温下的半致死温度（LT50），这一方法广泛适用于各类植物耐寒性的研究。朱根海等[5]研究指出，利用相对电导率和Logistic方程得出的拐点温度，能够较为准确地估算出植物组织的低温半致死温度，这种方法在多种植物的抗寒性研究中都有应用价值。
木芙蓉（HibiscusmutabilisL）亦称为拒霜花，属于锦葵科木槿属落叶灌木或小乔木。木芙蓉原产于中国，在长江以南地区有上千年的栽植历史，在我国南方多个地区均有分布，其中在成都地区分布最为广泛，为成都市市花。随着成都“花重锦官”“天府文化”“美丽宜居公园城市”建设的推进和深入，芙蓉花愈来愈受到重视。2022年，多部门联合印发《成都建设践行新发展理念的公园城市示范区总体方案》，作为成都公园城市示范区建设的标识性花卉和重要文化传承载体，对木芙蓉的深入研究已被列为成都市重点科研项目之一。目前，相关研究报道显示，在木芙蓉基因沉默技术、对烟粉虱抗性等研究领域取得了一定进展[6-7]。然而，对于木芙蓉耐寒机制和机理的相关研究却报道较少，已有的研究结果之间也存在一定争议。本研究通过对木芙蓉品种‘单瓣白’瓶苗叶片进行低温胁迫处理，并应用相对电导率和Logistic方程计算半致死温度，旨在为木芙蓉引种提供理论依据。
1材料与方法
1.1供试材料
本次试验中使用的木芙蓉供试材料为当年播种萌发的‘单瓣白’瓶苗。播种后将瓶苗保存在25℃、光照12h/黑暗12h的气候室中。‘单瓣白’为成都市植物园（成都市公园城市植物科学研究院）自主培育品种。
1.2试验设计
‘单瓣白’播种出苗后60d，剔除弱苗和病苗，保留长势一致的健康苗。为研究木芙蓉响应低温胁迫的耐寒机制，共设计了5℃、0℃和-5℃3个低温处理和1d，3d，7d3个时长处理，将不同温度和不同处理时长进行组合，共计9个处理组，2024年7月18日上午9：30对处理组分别进行取样测定。每个处理组均设置3次生物学重复。
1.3相对电导率测定
测定木芙蓉叶片相对电导率时，用剪刀沿叶脉将叶片剪成长条形，选取10个切碎的叶片，随即放入试管内并注入20mL蒸馏水。封口后在小型水平摇床上慢速震荡1h后，置于沸水中加热20min，待其恢复至常温后，将纯净水作为参照样本。本试验使用奥利龙150A电导率仪，测量不同处理条件下木芙蓉叶片加热前的电导率数值C1、加热后电导率值C2，及对照电导率值C0，重复3次。并按式（1）计算相对电导率：
将计算出来的相对电导率进行Logistic方程回归分析，具体回归方程如式（2）
式（2）中，y为相对电导率值，t为处理的温度；k为细胞伤害率的饱和容量，在本试验中为100。确定方程参数后通过回归分析，得到的曲线拐点，计算如式（3）：式（3）中，t为木芙蓉叶片低温半致死温度（LT50）[8]。
1.4数据分析
电导率测定结果采用3次重复的平均值进行计算，以减少随机误差的影响。使用Excel2010软件统计试验数据及计算低温半致死温度（LT50）。利用R语言完成双因素方差分析。利用“最小二乘法”计算低温半致死起点温度（C）和积温（K）。计算公式如式（4）：
2结果与分析
不同低温下木芙蓉幼苗处理1d的条件下回归方程拟合度较低，因此，本次试验只测定其相对电导率。
由图1可知，不同处理条件下，相对电导率范围为8.37%~77.92%，在-5℃的环境下，经过7d的处理，电导率猛增至77.92%，是-5℃/3d（相对电导率为29.57%）处理组下的2.63倍，表明木芙蓉叶片细胞膜受到严重损害。在5℃处理条件下，随着时间的增加，其相对电导率无明显变化，表明冷害胁迫对木芙蓉的负面影响较小。先前研究成果指出，在多样化的低温作用下，植物细胞相对电导率的变化趋势符合Logistic方程模型，通过回归分析得到的方程具有较高的可信度和精准性。本试验中通过回归方程确定拐点温度（LT50），即为其低温半致死温度。
由表1可知，处理3d和7d的方程R2分别为0.8348和0.8421，表明回归方程有较好的拟合度。在3d处理时长下，木芙蓉叶片低温半致死温度为-12.14℃，而在7d处理时长下，木芙蓉叶片低温半致死温度为-2.29℃，说明不同处理时间对木芙蓉叶片细胞的影响也有差异。因此，利用双因素方差分析进行验证。
由表2可知，主因子（时间和温度）和交互因子的P值分别为3.70E-08、9.15E-07和2.59E-06，均＜0.01，表明时间因子、温度因子及交互作用对木芙蓉叶片相对电导率均有极显著影响。
由表3可知，-5℃/7d处理下，木芙蓉叶片相对电导率极显著高于其他处理，而在5℃处理时，不同处理时长间的差异不显著，表明可能冷害对木芙蓉的影响不严重，且不会随时间的增加而加重。此外，基于上述研究结果，在本研究中引入了积温的概念来描述低温对木芙蓉的影响。
由表4可知，5.1℃以下才会开始对木芙蓉叶片造成伤害，且累积到-51.71℃/d时，木芙蓉叶片细胞相对电导率达到50%（即处于半致死状态）。
由表4可知，5.1℃以下才会开始对木芙蓉叶片造成伤害，且累积到-51.71℃/d时，木芙蓉叶片细胞相对电导率达到50%（即处于半致死状态）。
3结论与讨论
遭受低温胁迫，首当其冲受到伤害的是细胞膜系统。关晓溪等[9]研究指出，在植物正常发育阶段，其细胞膜以液晶状维持稳定状态。然而，一旦遭遇低温逆境，细胞膜将经历相变过程，由液晶态转变为凝胶态，进而引发细胞膜结构的重塑，使得膜透性上升，内部电解质流失加剧，从而影响了植物的正常生长。鉴于此，细胞膜透性的改变已成为衡量植物抗寒能力的显著指标之一[10]。
本研究表明，低温对木芙蓉叶片的负面影响不仅受温度梯度的影响，而且会受胁迫时长的影响。已有的研究报道大多只考虑不同低温对植物的影响，忽略了低温胁迫时长以及温度/时长交互因子对木芙蓉叶片的影响。因此，在本研究中引入积温的方法来评价低温对木芙蓉的影响，以期能够得到相对准确的评价结果。此外，试验结果还表明，0℃以上的冷害胁迫对木芙蓉叶片细胞的破坏、影响较弱，而0℃以下的冻害胁迫对木芙蓉叶片伤害较大。尤其是随着处理时长的增加，冻害对木芙蓉叶片的破坏差异更加明显，这可能是因为冻害胁迫会使植物组织结冰，从而造成不可逆的伤害。
有研究报道显示，基于最大熵值模型（Maxent模型）评价了我国木芙蓉的最适宜分布中心主要位于湖南和贵州，在未来低等至中等碳排放情景（SSP1-2.6、SSP2-4.5）条件下与目前相比，木芙蓉适生区的面积在我国呈先减小后增大的趋势。此外，评价不同环境因子的重要性还发现，温度也是影响其分布的重要因子[11]。由此可知，从温度适应性角度而言，木芙蓉不适宜引种到0℃以下低温持续时间较长的地区，而在南方大多数地区，木芙蓉都适宜引种栽植，这与最大熵值模型（Maxent模型）评价结果基本契合。此外，本研究的结果也能一定程度上解释木芙蓉为何能在南方秋冬季节开花，是因为它对低温冷害有一定抵抗能力，尤其是南方秋季温度一般在5℃以上，基本不会对木芙蓉的生长发育等产生负面影响。只有遭遇长期的低温冻害才会对木芙蓉的生长发育产生负面影响。而低温冻害除了本身会对植物产生影响，还可以通过对土壤的影响，间接影响木芙蓉的生长。
尽管本研究在低温胁迫对木芙蓉叶片的影响研究上取得研究结果，但仍存在一些局限性。首先，试验样本数量有限，未来可以通过增加样本量来提高数据的代表性。其次，试验周期较短，未能全面评估长期低温胁迫对木芙蓉的影响。最后，本研究主要关注电导率的变化，未来可以结合其他生理、生化指标（如抗氧化酶活性、膜脂组成等）进行综合评价分析，以期能更加全面地揭示木芙蓉的耐寒机制。此外，随着木芙蓉VIGS沉默载体构建成功[6]和转录组测序技术的日渐成熟，对木芙蓉耐寒基因的筛选鉴定也是今后研究的重点方向。例如，CBF-COR调控通路上的一些关键基因，应成为未来木芙蓉研究的重点关注内容。
