菊花Mlo基因家族鉴定及进化分析

菊花Mlo基因家族鉴定及进化分析

 

摘要：MLO基因家族成员是响应白粉病感染重要的转录因子，通过研究菊花MLO基因家族成员的结构和功能，为菊花对白粉病的抗性研究提供技术支持。通过生物信息法鉴定出29个菊花基因家族成员，采用Mega、ClustalX、MEME等软件分析菊花MLO基因家族成员特点。29个MLO基因家族成员可分成5个亚家族，其中第五亚家族的成员进化最保守。

 

染色体加倍是菊花Mlo基因家族扩张的主要方式。结果表明，菊花的茎和叶片是感染白粉病的主要部位，其中，位于第五亚家族成员CHR00028777-RA和CHR00082026-RA响应于菊花的茎部，可能是响应菊花白粉病的主要基因。研究结果分析了菊花MLO基因家族成员特点，发掘了与菊花白粉病相关的重要基因，研究结果揭示菊花白粉病干扰的分子机制，对提高菊花对白粉病抗性研究有重要的意义。

 

菊花是多年生草本植物，为单叶互生，头状花序。外围为舌状花，为短日照植物[1]，是我国十大传统名花，有上千年的栽培历史[2]。菊花被誉为“花中四君子”，观赏价值和药用价值较高，具有散风清热、平肝明目、抗菌、抗肿瘤等功效。由于菊花拥有较高的经济价值，我国菊花种植面积逐年增加。但在菊花生长过程中会遭受各种病害，其中白粉病是菊花生产过程中常见的病害之一[3]。该病菌属子囊菌亚门真菌，闭囊壳扁球形，菊花感染后在其叶片会布满白色霉状物，严重者会扭曲脱落。长期以来，防治白粉病主要采用化学防治法，然而大量使用农药，不仅污染环境，也使得菊花品质大打折扣。所以，提高菊花抗病能力、培育抗病菊花品种成为园艺植物病害防治的研究热点。

 

MLO是一个重要的植物特有基因家族[4]，是公认为对白粉病特有的“感性基因”，MLO家族成员一般由N端和C端组成，在接近C末端的位置是一个保守的CaMBD结构域，这是MLO基因家族成员的重要特征[5]。MLO基因于1942年首次在大麦中被发现，随着科学技术的进步和分子生物学的发展，大量MLO基因家族成员被鉴定[6]。研究菊花MLO家族成员的特点和功能，有助于更好地理解白粉菌对菊花的侵染机制。关于MLO家族成员对白粉病的广谱抗性机制和特点有大量研究。Daeun[7]等将番茄SlMlo1基因的28个突变转移到番茄品种中，通过表型分析，发现SlMlo1在白粉病侵染过程中有重要作用。

 

Consonni[8]等通过基因编辑技术，将拟南芥AtMlo2、AtMlo6、AtMlo12诱导突变，这3种基因突变，通过与正常植株对比，其感病率为80%，证明MLO在植物对白粉病的抗性更多的是负向调节。Cheng[9]等研究发现，黄瓜在镉胁迫下时，MLO基因表达量会明显升高，说明MLO基因还参与各种生物胁迫过程，还有学者发现，在不同植物中MLO基因功能还受到植物激素的影响，随着测序技术的发展，在基因组水平上鉴定MLO成员功能成为学者的研究热点。目前，关于MLO家族成员信息和功能在金银花[10]、南瓜[11]等物种中都已经研究，但在菊花中还未见报道。

 

菊花不仅是重要的花卉植物，还是研究园艺植物的模式植物，相对于其他植物MLO基因家族成员生物学功能，菊花MLO基因功能研究不够深入。随着菊花基因组的释放，使得在基因水平上研究菊花MLO家族成员特性成为可能。本研究通过对菊花MLO家族成员鉴定、系统发育、染色体定位等一系列的生物信息分析，加深了对菊花MLO家族成员的认识。研究结果为解释MLO基因家族成员功能提供基础数据，为培育康菊花抗白粉病提供新的种质资源。

 

1材料与方法

 

1.1菊花MLO基因家族成员的鉴定

 

菊花MLO基因序列下载菊花基因组数据库（http://www.amwayabrc.com/zh-cn/index.html），利用在线软件Blast对比序列，筛选剔除重复序列。然后通过Smart（http://smart.emblheidelberg.de/）软件，确定候选基因是否含有MLO基因特有的保守基序。

 

1.2菊花MLO基因家族成员多重比较分析

 

通过在线软件ClustalX，将所得到的MLO基因序列进行氨基酸对比，获得氨基酸顺序、序列位点等各种基本信息。

 

1.3构建菊花MLO基因家族成员进化树

 

采用Mega[12]软件进行菊花MLO基因进化分析，本研究采用邻近法（NeighborJoining，N-J）构建进化树，检验参数设置为1000。结果保存为Fasta格式，模型选择为Poissonmode，最后使用AL软件美化进化树。

 

1.4菊花MLO基因家族成员结构分析

 

利用MEME（v5.3.3）（http://meme-suite.org/tools/meme）分析MLO基因家族成员保守结构，本次motif数量设置为10个。利用软件GSDS（http://gsds.gao－lab.org/）分析外显子和内含子结构，最后使用TBtools软件，将系统进化树、基因结构及蛋白保守基序分析结果合并作图。

 

1.5菊花MLO基因家族成员基因定位

 

以菊花基因编号在中检索其在染色体上的位置，统计位置信息。整理成MAP文件，在此基础上，使用TBtools软件绘制染色体信息。

 

1.6菊花MLO基因家族成员表达分析

 

利用菊花基因组数据库信息（http://www.amwayabrc.com/zh-cn/index.html），检索菊花不同生长阶段不同器官中MLO基因的表达水平，并根据所取得的数据，使用pheatmap软件绘制热图。

 

2结果与分析

 

2.1菊花MLO基因家族成员的鉴定结果

 
 

通过菊花基因组数据库官网（http://www.amwayabrc.com/zh-cn/index.html）下载的基因组序列，通过Smart软件筛选和Blast鉴定，最终发现29个基因含有MLO基因家族成员特有的保守序列。由表1可知，基因序列最长的是CHR00062735-RA，最短的是CHR00045893-RA，

提示MLO基因家族成员在进化过程中变化比较大。为进一步了解MLO基因家族基本信息，使用Clustalw软件，比对菊花MLO基因家族成员的氨基酸顺序，大部分氨基酸序列都含有MLO基因特有的保守序列（见图1）。

 

2.2菊花MLO基因家族进化分析

 

为进一步理清MLO基因家族成员之间的关系，对鉴定的29个MLO基因家族成员系统进行进化分析。由图2可知，MLO基因家族成员分为5个亚家族，其中第一亚家族成员最多，分离出8个成员，第二亚家族和第三亚家族都分离出来6个成员，第四亚家族和第五亚家族成员最少，分别是4个成员。此外还发现，基因CHR00051066-RA自展为一个分支，位于第四亚家族和第五亚家族。系统发育树可反映亚家族成员之间的相近程度。

 

从菊花MLO家族基因进化的分析结果可知，同亚家族之间亲缘关系更近。进化树自展率是检验进化分枝的可信度，该范围为1%~100%。分数越高，说明结果越可靠。在本次分析中，第二、三、五亚家族的自展率都在95%以上，说明结果可靠，基因进化相对稳定；第一亚家族的自展率相对较低，暗示本家族成员变异较大，需要进一步研究。

 

2.3菊花MLO基因家族结构分析

 

为进一步解释MLO基因家族不同亚家族之间的联系与区别，使用MEME软件，对MLO基因家族成员进行结构分析。由图3可知，MLO基因家族成员相对保守，其中，第五亚家族motif数量最多，且次序不变，说明在进化过程中，第五亚家族进化最保守。第四亚家族成员motif数量次序不变，但相对较少，可能是区分第五亚家族和第四亚家族的最主要依据。

 

在第一亚家族中，motif数量最多为10个，最少为3个，且顺序排列紊乱，暗示本家族稳定性较弱，在进化过程中可能出现基因片段丢失现象，这也为新基因产生提供了基础。值得注意的是，第二、三、家族成员也出现了motif丢失现象，比如，CHR00045893-RA基因只有2个motif，说明motif数量的丢失不影响MLO基因家族的亲缘关系。

 

2.4菊花MLO基因家族成员定位

 

为了进一步研究MLO基因家族基本信息，使用TBtools软件，分析MLO基因家族在染色体上的分布情况。由图4可知，MLO基因29个家族成员分布在菊花26条染色体上，大部分基因家族成员位于染色体末端，也有定位于尖端的基因，如CHR00015738-RA基因，同时，发现定位于utg24049染色体上基因CHR00055995-RA和CHR00055996-RA位置相近，可能是经过基因复制事件产生并保留下来的。有报道基因家族的扩张事件有染色体加倍、串联复制、染色体片段复制、反转录制复制和外显子重组事件。本次定位结果显示，排除CHR00055995-RA和CHR00055996-RA所有的MLO基因并没有出现串联现象，基因定位于不同染色体，说明MLO基因家族扩张更多是染色体加倍引起的。

 

2.5菊花MLO基因家族成员表达分析

 

为了了解MLO基因家族成员的功能，以菊花根、茎、叶、花为参考标准，绘制了MLO基因家族成员的表达热图。由图5可知，MLO基因家族成员大部分在菊花茎中表达，暗示菊花感染白粉病菌的最主要部位是茎。在菊花叶片中也有很多基因表达，说明叶片也是菊花白粉病感染的主要场所。有些基因只在菊花的特定器官，如CHR00010676-RA只在菊花茎中表达，这些基因可能具有专一特性。还有一些基因，如CHR00005249-RA在所有的器官中都不表达。说明这一类基因在进化过程中丢失了对白粉病的抗性功能。还有一些基因在所有器官中表达，说明这些基因对白粉菌的感染具有广谱性，MLO基因家族在不同器官、不同组织都有不同的表达，说明在进化过程中，MLO基因家族通过功能多样化来适应环境变化引起的反应。

 

 

3讨论

 

3.1菊花MLO基因家族进化分析

 

MLO基因家族作为重要的转录因子，已经被证明在植物中是一种具有白粉病广谱抗性的基因家族成员，所以研究MLO基因家族相关特征，对深入研究菊花MLO基因家族基因的遗传改良和表达模式具有重要的借鉴意义[13-14]。目前，学者对南瓜、金银花、木薯等基因家族进行鉴定，发现南瓜中有20个成员，金银花中有25个成员，木薯中有21个，说明不同物种基因家族数量不同。但通过生物信息分析发现，大部分基因家族成员都可分为5个亚家族，说明基因家族成员数量的多少不影响基因分类和进化。

 

暗示MLO基因家族在进化历史中，选择性保留了重要特征。本试验通过对鉴定出来的29个基因进化分析发现，菊花MLO基因家族成员分为5个亚家族。这与其他物种基因家族成员分类结果一致，即MLO基因家族主要有5类不同类型的特征基因在进化中选择性地保留下来。为了进一步确定这5类基因亚家族的特点，本研究结合进化树分析了MLO基因亚家族的结构特点[15]。

 

结果发现，同一亚家族内的基因结构相似，在所有的亚家族成员中，第五亚家族成员进化比较保守。有研究表明，基因家族进化过程中分为2种方式，分别是保守进化和发散扩张[16]，其中，保守进化基因可能对植物生长、抵御外界逆境干扰有重要作用[17]。通过本次进化分析和结构分析表明，菊花第五亚家族进化保守性最好，暗示第五亚家族成员对菊花有重要作用。

 

3.2菊花MLO基因家族功能分析

 

植物的生长是一个复杂的多因素过程，在此过程中，转录因子和基因家族起重要作用[18]。植物经过长时间的进化，基因家族成员在功能上分化，使其能够应对植物面临的各种逆境胁迫[19]。基因家族在植物生长过程中有重要作用，研究基因家族的功能，有利于更好地把握植物生命本质。MLO基因家族被公认为是白粉病的主要感性基因，但MLO基因家族成员数量众多，关于其具体的抗病机理还不清楚。

 

有学者研究发现，不同植物中的MLO基因功能不一样，如在单子叶植物中，对白粉病敏感的基因是第1~4家族[20]，但在双子叶中，对白粉病敏感的基因家族成员更多地集中在第五亚家族。本研究利用菊花基因组数据库，对鉴定出来的MLO基因通过构建进化树，发现MLO基因成员CHR00082026-RA、CHR00082028-RA、CHR00028777-RA和CHR00028773-RA，位于第5亚家族，结合外显子和内含子的排列顺序分析和染色体定位分析，可以得出结论：CHR0-0028773-RA基因、CHR00082028-RA分别由CHR-00028777-RA和CHR00082026-RA通过菊花复制事件产生。通过热图结果可得出，成员CHR00028777-RA和CHR00082026-RA基因都是白粉病的响应基因，且在菊花的茎部表达有很高的表达量。暗示菊花的茎部是白粉病感染最重要的部分，在生产中需要注意菊花的茎部感染白粉病的危险。

 

4结论

 

综上所述，本研究在菊花中鉴定出29个MLO基因，并利用生物信息学手段对这些基因的基本信息进行分析，通过系统进化分析发现，菊花MLO基因可分为5个亚家族，motif结构和数量可能是影响分类的主要因素。通过功能分析可知，茎可能是菊花感染白粉病的主要部分。