低温预处理对‘红色龙沙宝石’月季离体培养芽诱导的影响
（徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州221006）
摘要：以‘红色龙沙宝石’月季为试验材料，将其带腋芽茎段放置于4℃低温预处理48h后进行离体培养，研究低温预处理对红龙月季芽诱导的影响。结果表明，低温预处理有利于红龙月季茎段芽的诱导，以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基的诱导效果最为理想。
‘红色龙沙宝石’是欧洲月季的品种，别名红龙、红色伊甸园，是蔷薇科蔷薇属落叶或半落叶大型藤本月季。其花色多样，花型典雅，花期持久，香味独特，其根、叶、花均可入药，具有较高的观赏价值和经济价值，被誉为“花中皇后”。
月季一般采用扦插方式进行繁殖，传统方法无法短期获取大量种苗，利用组织培养技术可使其增殖周期大大缩短，优良品种得以快速繁殖。而外植体芽诱导是离体快繁的一项关键技术，往往成为阻碍月季组织培养技术应用的瓶颈。本试验以红龙月季的带腋芽茎段为外植体材料，研究了低温预处理、不同激素配比对红龙月季芽诱导的影响，以期为优化红龙月季组织培养技术及大规模组培生产提供参考。
1材料与方法
1.1供试材料
试验材料取自徐州生物工程学院琴湖园艺场。
1.2试验方法
1.2.1外植体的取材与低温预处理。
4月选取红龙月季腋芽饱满且尚未萌发的当年生健壮枝条，除叶去刺，并去除上端3个顶芽，将其剪成带2~3个腋芽的小段，用保鲜膜包裹放置于4℃冰箱中低温预处理48h。
1.2.2外植体无菌材料的获取。低温处理后的外植体先用洗涤剂清洗，再用流水冲洗2~3h，冲洗干净后带入超洁净工作台，将其用灭菌剪刀剪成1.5cm左右的单芽小段，放在75%酒精溶液中浸泡30s，然后用无菌水冲洗2~3遍，再用0.1%升汞消毒10min，而后用无菌水冲洗4~5遍，每次冲洗不少于3~5min，最后用无菌滤纸吸干备用。
1.2.3初代培养。
培养基：以未经低温处理为对照，以MS为基础培养基，另加0、0.5、1.0、2.0mg/L的6-BA和0、0.1、0.3、0.5mg/L的NAA，同时加入3%的蔗糖和0.6%的琼脂，pH值调节为5.8。培养条件：培养温度为25±2℃左右，光照强度为2000Lx，光照时间为12h/d。培养方法：在初代培养基上接种已消毒的外植体，每瓶接种1个，各处理每次接种30瓶，重复3次，5d后观察并统计芽诱导情况，30d后统计污染率和褐变率，根据统计结果筛选出诱导性最优的培养基。数据统计分析采用SPSS19.0软件。
2结果与分析
2.1不同激素配比对芽诱导的影响
由表1可知，在相同的培养条件下，常温（对照）和低温2种处理各种浓度梯度的MS芽诱导作用呈显著差异。低温未添加激素培养，7d红龙月季芽开始萌动，18d开始发芽，大部分茎段能发1个芽，芽诱导率可达74.44%，长势较好。当6-BA为0.5mg/L、NAA为0.3mg/L时，常温（对照）表现为愈伤组织较多，大部分愈伤组织不分化芽；低温处理则是生长慢，芽小，大部分茎段能发1个芽；两者芽诱导率分别为14.44%和78.89%。
当NAA浓度最高，6-BA与NAA比值为1︰1时，此时芽的生长和分化受到抑制，常温、低温处理均表现为外植体萌芽慢，愈伤组织较多，大部分愈伤组织不分化芽，少数茎段能发1个芽，芽的诱导率分别为15.56%和17.78%。当6-BA和NAA浓度均最高，外植体生长慢，叶易发黄，常温（对照）芽诱导率为11.11%，多数外植体发生褐变而死亡；而低温芽诱导率可达72.22%，仅少数外植体褐变死亡。
当6-BA为1.0mg/L、NAA为0.1mg/L时，低温处理培养5d芽开始萌动，12d开始萌发，外植体生长快，健壮，大部分能够出芽1~3个，芽诱导率高达92.22%；而常温处理的15d萌发，出芽个数略少，且污染率、褐变率高。表明此浓度激素配比低温处理的诱导效果较为理想，芽诱导率最高，腋芽生长最快，丛生芽数量最多，生长状况最好，污染率及褐变率也最低。
当NAA浓度最高，6-BA与NAA比值为1︰1时，此时芽的生长和分化受到抑制，常温、低温处理均表现为外植体萌芽慢，愈伤组织较多，大部分愈伤组织不分化芽，少数茎段能发1个芽，芽的诱导率分别为15.56%和17.78%。当6-BA和NAA浓度均最高，外植体生长慢，叶易发黄，常温（对照）芽诱导率为11.11%，多数外植体发生褐变而死亡；而低温芽诱导率可达72.22%，仅少数外植体褐变死亡。
当6-BA为1.0mg/L、NAA为0.1mg/L时，低温处理培养5d芽开始萌动，12d开始萌发，外植体生长快，健壮，大部分能够出芽1~3个，芽诱导率高达92.22%；而常温处理的15d萌发，出芽个数略少，且污染率、褐变率高。表明此浓度激素配比低温处理的诱导效果较为理想，芽诱导率最高，腋芽生长最快，丛生芽数量最多，生长状况最好，污染率及褐变率也最低。
2.2低温处理对芽诱导效果的方差分析
由表2可知，低温各不同激素配比处理对于红龙月季茎段外植体的诱导率、萌芽数、出芽时间、污染率和褐变率5项的影响全部均呈显著差异（*p＜0.05、**p＜0.01）。
3结论与讨论
试验表明，在相同的培养条件下，各低温处理均能不同程度地诱导红龙月季出芽，且生长状况良好，外植体褐变较轻，污染率较低，总体上芽诱导效果显著高于常温处理。今后的组培中可以考虑接种前低温预处理材料，并推广应用，以优化技术体系，扩大欧洲月季规模组培生产。
从本试验可看出，未添加激素的低温处理，外植体也能分化出芽，且生长良好，叶色浓绿。可能是低温利于打破腋芽休眠，能够促使腋芽萌发和生长所致。许多文献表明，大多数植物通过低温处理有利于芽诱导，这与本试验研究结果基本一致。
试验研究发现，红龙月季中部茎段诱导率、芽萌发率和生长状况均明显高于上部和下部，这可能是由于月季中部的芽在诱导阶段内营养水平较高，芽的发育质量较好，加之发育阶段外界条件适宜，且外观上腋芽比较充实饱满，萌发能力较强，因此抽生的枝叶也较多。
在本试验中，低温处理月季腋芽诱导萌芽快、生长健壮且接种外植体污染率低。可能是用保鲜膜包裹月季枝条，可达到保湿促进腋芽萌发的目的；经过低温冷藏，能够有效抑制细菌及真菌的生长，确保月季腋芽基部周围无菌，减少了外植体切取过程中材料的污染，从而提高茎段腋芽外植体的接种成活率。具体原因有待进一步探讨。
