47个月季花瓣圆片中100%都能染出蓝色

Rh OOMT2 的启动子具有比 35S 更强的活性

 

在月季、洋桔梗和百合花瓣圆片中进行 35S::GUS、pro Rh OOMT2::GUS、pro Rh CCD4::GUS 和pro Rh NUDX1::GUS 的瞬时表达。 

 

结果（表 1）表明，转化 Rh OOMT2 启动子的 47 个月季花瓣圆片中 100%都能染出蓝色，在 81个洋桔梗花瓣圆片中有 30.9%能染出蓝色，在 50 个百合花瓣圆片中有 82%呈现出不同程度的 GUS染色，并且染色信号较强，相应的，转化 35S 的月季、洋桔梗和百合中无论是染色花瓣圆片的数量还是染色程度都明显弱于 Rh OOMT2 启动子。转化 Rh CCD4 启动子的百合中 43.5%的花瓣圆片呈现一定程度的蓝色，但信号较弱，而在月季和洋桔梗中几乎没有染色。Rh NUDX1 的启动子在月季、洋桔梗和百合的花瓣中几乎没有活性。 

 

由于 35S 和 Rh OOMT2 的启动子活性在月季花瓣中都不够强，推测可能是试验材料对启动子的活性有所影响。因此，选取‘萨曼莎’、‘戴安娜’、‘香槟月季’和‘雪山’4 个月季品种作为试验材料，来验证不同材料对启动子活性的影响，且进一步比较 Rh OOMT2 与 35S 的启动子活性。结果（图 6）表明，4 个品种中的 Rh OOMT2 启动子活性比 35S 强，但品种间差异较大，‘戴安娜’>‘萨曼莎’>‘雪山’>‘香槟月季’。

 

综合以上结果，认为 Rh OOMT2 的启动子在花瓣中拥有比 35S 更强的活性。

 

本研究中以‘无核白’葡萄未开放的花蕾为外植体，操作简便快速，节省人力，可提高试验的重复性与准确性；同时也为通过体胚发生途径建立高效完整的再生与遗传转化体系提供较充足的材料。通过比较 2,4-D 与不同浓度（1.0、2.0 和 3.0 mg · L-1）褪黑素对愈伤组织的诱导作用，发现褪黑素缩短了小花蕾脱分化产生愈伤组织所用的时间，较 2,4-D 缩短了 14  d，为其所用时间的一半，且愈伤组织诱导率均达 70%以上，显著高于 2,4-D。

这与滇黄芩愈伤组织的诱导结果（张来军和贾敬芬，2013）相似。但本研究中不同浓度褪黑素处理下愈伤组织诱导率并无明显差异，可能与浓度梯度设置较少有关。通过 2,4-D 诱导葡萄小花蕾并无胚性愈伤组织形成，推测可能与培养基组分有关。同一葡萄品种在不同培养基上诱导效率差异很大（Kikkert et al.，2005；Dhekney et al.，2009）。 

 

在以往研究中，利用葡萄不同器官的细胞脱分化形成胚性愈伤组织，继而产生原胚团再分化成不同的器官或者体细胞胚，不同组织阶段诱导过程耗时较长，一般需 6 ~ 10 个月。本研究中发现褪黑素能够在‘无核白’葡萄花蕾愈伤组织继代培养 120  d 时诱导形成体细胞胚，且完成体细胞胚再生的周期缩短了近 3 个月。本研究结果显示，1.0  mg  ·  L-1褪黑素诱导体胚形成胚根较 2.0 和 3.0 mg · L-1褪黑素处理生长较快且体胚发生率高，而 2,4-D 诱导处理无体细胞胚形成，表明低浓度的褪黑素有利于体胚的形成，这可能是褪黑素作为与 IAA 具有相同生理功能的植物外源生长物质，通过刺激调节胚状体内源的 IAA 与褪黑素或其他内源激素的水平，促进胚状体的分化与发育。



已有研究证明，在咖啡叶器官发生途径中添加 100 μmol · L-1褪黑素和 0.93 μmol · L-1激动素（Kinetin）改变了愈伤组织内源褪黑素和 IAA 水平从而促进了体细胞胚的诱导（Ramakrishna et al.，2012）。也有研究表明，0.1 μmol · L-1外源褪黑素提高了芥菜（Brassica juncea）内源 IAA 水平，推测褪黑素促进生根的原因是外源褪黑素刺激内源 IAA 的合成（Chen et al.，2009）；而 10.0 μmol · L-1褪黑素抑制植物生长可能是由于 IAA 诱导乙烯合成引起的（Hernández-Ruiz et al.，2005）。 

 

在葡萄体细胞胚再生体系建立过程中，畸形胚的频发现象引起研究者的广泛关注。本试验中在体细胞胚萌发与成苗过程中也发现，不同浓度褪黑素诱导的畸形胚发生率均较高，多呈现玻璃化胚、愈伤组织化胚、单级胚或无胚芽的子叶畸形胚，并且 2.0 和 3.0 mg · L-1褪黑素处理下畸形胚发生率较高，这可能与褪黑素浓度过高、生长素与细胞分裂素的配比、体胚自身生长状态等均有很大关系。有研究指出，高浓度的外源植物生长调节剂大大提高了畸形胚的发生率（Buchheim et al.，1989；何业华  等，2007）。

 

因此，后续研究还需要对褪黑素与细胞分裂素的浓度配比进行优化，以减少畸形胚的发生。同时，目前仍不明确褪黑素促进体胚发生的作用机理，有待于从分子生物学等角度进一步解析激素、基因表达及代谢调控层面的作用机理。