1材料与方法
1.1月季花候选基因与试材取样
基于Pei等（2013）发表的月季转录组测序和相关文献报道（Scallietetal.，2006；Imaietal.，2013；Magnardetal.，2015），选取了13个花色、花香相关基因，包括与香气相关的基因RhOOMT2（GenBank序列号AF502434）和RhNUDX1（M4I1C6），类胡萝卜素代谢相关基因RhCCD4（MG922975），以及花青素合成相关基因RhPAL（MG922976）、RhC4H（MG922977）、Rh4CL（MG922978）、RhCHS（AB038246）、RhCHI（MG922979）、RhF3H（MG922980）、RhF3'H（MG940858）、RhDFR（AB490072）、RhANR（MG940859）和RhUFGT（MG940860）。
组织特异性表达试验材料取自切花月季品种‘萨曼莎’3个不同的植株，取主根的中间部位、茎干的中间部位、健壮枝条中部的成熟叶片、盛花期花朵的中层花瓣。取样后立即用锡箔纸包好放入液氮中。花瓣中瞬时表达试验材料是从花卉市场上购买的新鲜月季‘萨曼莎’、‘戴安娜’、‘香槟’和‘雪山’及洋桔梗‘GreenPelleted’和东方百合‘西伯利亚’切花，在1h内运送到实验室，在自来水中剪切花枝，保留长25cm的花茎，然后置于蒸馏水中瓶插4~6h后开展后续试验。
1.2月季的RNA提取和基因表达分析
使用热硼法提取月季的总RNA（Maetal.，2006）。参考反转录试剂盒说明书（全式金），根、茎、叶和花瓣各取1μgRNA合成cDNA模板，3个生物学重复。基因表达分析以RhActin5为内参，13个候选基因的相对表达水平使用2-ΔΔCT计算，以根中相对表达水平为1。半定量RT-PCR使用的仪器为AppliedBiosystems?Veriti?ThermalCycler（ABI），qRT-PCR所用2×SYBRGreenqPCRmix试剂盒（艾德莱），仪器为LightCycler?96（Roche）。
使用SPSS22对荧光定量PCR结果进行单因素方差分析（One-wayANOVA），采用Duncan’s法进行多重比较，α=0.05。
1.3启动子克隆和载体构建
使用CTAB法从月季品种‘萨曼莎’的嫩叶中提取DNA（Jabbarzadehetal.，2009）。使用FPNI-PCR方法（Wangetal.，2011），从月季基因组DNA上克隆了RhOOMT2、RhCCD4和RhNUDX1的启动子序列。使用I-5TMHi-FiDNA聚合酶（MCLAB）校正序列。根据真核启动子数据库（http：//epd.vital-it.ch/promoter_elements.php）和基因Ⅷ（BENJAMINLEWIN，2004）预测转录起始位点、TATA-box和CAAT-box。在上预测启动子中的顺式元件。通过HindⅢ和BamHⅠ限制性酶切和连接，将RhOOMT2、RhCCD4和RhNUDX1的启动子插入PBI121载体，替换35S启动子。
1.4花瓣中基因的瞬时表达和GUS染色
在月季、洋桔梗和百合花瓣中进行目的基因启动子的瞬时表达。取盛开期花朵的中层花瓣，用打孔器从花瓣的中部取直径为12mm的圆片，浸泡在携带目的基因载体的农杆菌EHA105菌液中（OD600=0.8）。通过真空抽吸侵染花瓣圆片，当气压降至0.4个大气压时开始缓慢恢复气压。之后将花瓣圆片平铺在蒸馏水浸润的滤纸上，23℃条件下暗培养3d。通过GUS染色确定启动子活性（Guoetal.，2017）。
