月季花瓣特异表达启动子的筛选和鉴定
摘 要：以月季品种‘萨曼莎’（Rosa hybrida‘Samantha’）为试验材料，选取了 13 个花色、花香相关的基因，研究其在根、茎、叶和花等器官中的表达规律及其启动子活性。结果表明，Rh OOMT2（Rosa hybrida orcinol o-methyltransferase 2）和 Rh CCD4（Rosa hybrida carotenoid cleavage dioxygenase 4）在花瓣中具有相对较高的表达量，Rh NUDX1（Rosa hybrida nudix hydrolase 1）在根部表达量最高，花瓣中其次，在茎和叶中几乎没有表达，另外 10 个类黄酮代谢途径相关基因在各器官中表达差异较小。
使用 FPNI-PCR的方法克隆到 ATG 上游 1 601 bp 的 Rh OOMT2 启动子、1 539 bp 的 Rh CCD4 启动子和 1 433 bp 的 Rh NUDX1启动子。将携带 Rh OOMT2、Rh CCD4 和 Rh NUDX1 启动子的 PBI121 载体通过农杆菌的介导，在月季‘Samantha’、洋桔梗（Eustoma grandiflorum‘Green Pelleted’）和百合（Lillium Oriental hybrida‘Siberia’）花瓣中进行瞬时表达，GUS 染色结果表明，与阳性对照 35S 启动子相比，Rh OOMT2 启动子在月季、洋桔梗和百合花瓣中具有更强的活性，Rh CCD4 启动子在百合花瓣中具有较弱的活性，而在月季和洋桔梗中活性很弱，Rh NUDX1 启动子则在 3 种花中均无活性。进一步在 4 个月季品种‘萨曼莎’、‘戴安娜’、‘香槟月季’和‘雪山’中比较了 Rh OOMT2 和 35S 的启动子活性，证实了在花瓣中 Rh OOMT2 启动子具有比 35S 更高的活性。
使用 FPNI-PCR的方法克隆到 ATG 上游 1 601 bp 的 Rh OOMT2 启动子、1 539 bp 的 Rh CCD4 启动子和 1 433 bp 的 Rh NUDX1启动子。将携带 Rh OOMT2、Rh CCD4 和 Rh NUDX1 启动子的 PBI121 载体通过农杆菌的介导，在月季‘Samantha’、洋桔梗（Eustoma grandiflorum‘Green Pelleted’）和百合（Lillium Oriental hybrida‘Siberia’）花瓣中进行瞬时表达，GUS 染色结果表明，与阳性对照 35S 启动子相比，Rh OOMT2 启动子在月季、洋桔梗和百合花瓣中具有更强的活性，Rh CCD4 启动子在百合花瓣中具有较弱的活性，而在月季和洋桔梗中活性很弱，Rh NUDX1 启动子则在 3 种花中均无活性。进一步在 4 个月季品种‘萨曼莎’、‘戴安娜’、‘香槟月季’和‘雪山’中比较了 Rh OOMT2 和 35S 的启动子活性，证实了在花瓣中 Rh OOMT2 启动子具有比 35S 更高的活性。
19 世纪，中国月季的持续开花和香味两个重要性状先后被引入到欧洲月季中，由此开创了现代月季育种的新纪元。现如今月季品种已经超过 30 000 种（Qi et al.，2018）。随着分子生物学技术的进步和植物遗传转化体系的逐渐完善，分子育种在花卉中已得到一定应用，在延缓石竹花朵衰老（Kosugi et al.，2002）、提高月季和百合抗逆性（Chen et al.，2016；闫笑 等，2018）、调控菊花花期（Yang et al.，2014；Wei et al.，2017）以及创制蓝色月季和菊花（Katsumoto et al.，2007；Noda et al.，2017）等方面展现出良好的发展前景。最近，日本 Nishihara 等（2018）运用 CRISPR/Cas9 技术在夏堇中敲除了 F3H 基因，获得了花色不同程度变异的转基因株系。
在转基因育种中，除了目的基因外，合适的启动子也是必不可少的。启动子有 3 类，包括组成型、诱导型和器官特异型启动子。组成型启动子可以诱导目的基因持续高表达，如广泛应用的 Ca MV 35S，还有泛素（Ubiquition）、肌动蛋白（Actin）和核酮糖–1,5–二磷酸羧化酶（Rubisco）小亚基的启动子（Rooke et al.，2000；Tanabe et al.，2015；Hong et al.，2016）等。但是组成型启动子有时会带来代谢失衡、毒性效应和非预期表型（He et al.，2014）。诱导型启动子广泛用于研究靶基因诱导表达后下游基因的表达变化，也可用于调节植物生长。
例如，在矮牵牛花开放过程中使用化学诱导型启动子 GVG 来控制乙烯的合成，并且在化学诱导剂地塞米松处理后，花朵寿命几乎延长一倍，并且乙烯的跃变峰也被推迟（Wang et al.，2013）。器官特异型启动子在研究特定组织器官中基因的功能具有重要作用，并且在改良特定组织器官的性状方面具有重要的应用价值。例如，利用根部特异表达的启动子来改善作物对养分的吸收（Li et al.，2019），利用叶片特异表达的启动子来延缓叶片衰老，促进光合作用（Ding et al.，2019），在花卉中利用花瓣特异启动子来改变花色和花形（Qi et al.，2013；Azuma et al.，2015；Kim et al.，2018）。
最近，Decaestecker 等（2018）利用器官特异型启动子对 CRISPR 技术进行改造，开发了 CRISPR tissue-specific knock-out（CRISPR-TSKO）的方法，从而更精确地定位到目标器官或组织来研究基因功能，或用于创制转基因新材料。这些研究表明，对于目的基因在花器官中的功能验证或花卉的分子育种，花瓣特异型启动子具有巨大的潜在应用价值。虽然一些花瓣特异型启动子已经被报道，但部分启动子可能存在花瓣特异性弱、活性低或是不适用于多种花卉等问题。
例如，在矮牵牛花开放过程中使用化学诱导型启动子 GVG 来控制乙烯的合成，并且在化学诱导剂地塞米松处理后，花朵寿命几乎延长一倍，并且乙烯的跃变峰也被推迟（Wang et al.，2013）。器官特异型启动子在研究特定组织器官中基因的功能具有重要作用，并且在改良特定组织器官的性状方面具有重要的应用价值。例如，利用根部特异表达的启动子来改善作物对养分的吸收（Li et al.，2019），利用叶片特异表达的启动子来延缓叶片衰老，促进光合作用（Ding et al.，2019），在花卉中利用花瓣特异启动子来改变花色和花形（Qi et al.，2013；Azuma et al.，2015；Kim et al.，2018）。
最近，Decaestecker 等（2018）利用器官特异型启动子对 CRISPR 技术进行改造，开发了 CRISPR tissue-specific knock-out（CRISPR-TSKO）的方法，从而更精确地定位到目标器官或组织来研究基因功能，或用于创制转基因新材料。这些研究表明，对于目的基因在花器官中的功能验证或花卉的分子育种，花瓣特异型启动子具有巨大的潜在应用价值。虽然一些花瓣特异型启动子已经被报道，但部分启动子可能存在花瓣特异性弱、活性低或是不适用于多种花卉等问题。
在本研究中，从月季的 13 个花色、花香相关基因中筛选花瓣特异表达基因，克隆了 Rh OOMT2、Rh CCD4 和 Rh NUDX1 的启动子，发现 Rh OOMT2 在月季花瓣中表达水平较高，并且在月季、洋桔梗和百合的花瓣中，其启动子的活性都高于 35S。
