1 材料与方法
1.1 试验材料与处理
Tra T2A 蛋白质、百合灰霉菌 Botrytis cinerea 分离保存于实验室 4 ℃冰箱中。45 d 苗龄的百合幼苗和 60 d 鳞片扦插百合幼苗(诱导抗病效果)种植于温室花盆中。
试验仪器有叶绿素荧光成像系统(Imaging-Pam,Walz,Germany)、显微镜(Nikon ECLIPSE E200)和测微尺等。
选取生长一致的、健康百合幼苗 40 株,分为 4 组,每组 10 株,分别进行对照(灭菌水)、接种灰霉菌(简称 IB,喷灭菌水后 48 h 接种 1 × 106个 · m L-1灰霉菌孢子悬浮液)、Tra T2A(Tra T2A 稀释 100 倍喷雾)、Tra T2A + IB(喷 Tra T2A 后 48 h 接种灰霉菌)4 个处理。每处理重复 3 次,共处理幼苗 120 株。
1.2 Tra T2A 诱导处理对百合叶片气孔及合光响应和荧光特性的影响试验
1.2.1 叶片气孔特性
分别于接种灰霉菌前 1 d,接菌后 1、3、5、7、9 d 用灭菌过的剪刀剪取百合植株上、中、下 3个部位的叶片,分别代表幼叶、生长中期及生长早期的叶片,灭菌水冲洗干净,每个处理观察 9 片叶,每个叶片选取 3 个部位(上、中、下)剪取大小 1 mm × 2 mm 的小叶块,在等量的 95%乙醇和冰醋酸混合液中固定 24 h,然后浸泡于饱和水合氯醛水溶液中,待组织透明后取出,制玻片,在 10 × 40 倍显微镜下观察、记录气孔数,测量气孔大小(李映霞,2004)。
1.2.2 叶片光响应
取上述接菌后 3 d 的百合幼苗叶片(每个处理 4 片),在 MAXI Imaging-PAM 的 Light Curve窗口设置光合有效辐射强度梯度分别为 0、9、20、29、40、56、75、102、133、165、204、297、370、455、580、725、922 μmol · m-2 · s-1,相邻光照强度之间间隔 10 s,由此可以得到 PSⅡ相对电子传递速率(ETR)随光强 PAR 增加的变化趋势。
1.2.3 叶片叶绿素荧光参数
取上述接菌后 3 d 的百合幼苗叶片(每个处理 4 片),从 9:00 开始,利用叶绿素荧光成像系统(Imaging-Pam,Walz,Germany)和荧光图像分析软件(Imagingwin,Walz)测定叶绿素荧光诱导动力学参数[室温(25 ± 2)℃,光强 3 000 μmol · m-2 · s-1]。用黑布遮光,叶片经 20 min 以上充分暗适应后,打开弱测量光(不大于 1 μmol · m-2 · s-1)测定初始荧光(F0),此时再打开一次饱和脉冲光(3 000 μmol · m-2 · s-1),测定叶绿素的最大荧光 Fm。然后在光化光下达到稳定后记录其稳态荧光(Fs),给一次饱和脉冲光测定 Fm′。
计算 PSⅡ的最大量子产量[Fv/Fm =(Fm–F0)/Fm,反映植物潜在最大光合能力]、PSⅡ的实际量子产量[ФPSⅡ =(Fm′–Fs)/Fm′,反映植物的实际光合效率]、光化学淬灭系数[qP =(Fm′–Fs)/(Fm′–F0′),由光合作用引起的荧光淬灭]、非光化学淬灭系数[NPQ =(Fm–Fm′)/Fm′,由热耗散引起的荧光淬灭]等荧光参数值(王振宇 等,2006)。
1.3 Tra T2A 诱导处理兰州百合抗灰霉病试验
根据以下分级标准,观察记录 Tra T2A + IB 和 IB 处理 5 d 和 7 d 的百合幼苗灰霉病发病情况,并计算病情指数及诱导抗病效果。
病害分级标准:0 级,叶片未发现病斑;1 级,病斑的面积占总叶片面积的 1%以下;2 级,病斑的面积占总叶片面积的 2% ~ 5%;3 级,病斑的面积占总叶片面积的 6% ~ 20%;4 级,病斑的面积占总叶片面积的 21% ~ 40%;5 级,病斑的面积占总叶片面积的 40%以上(梁巧兰 等,
2016)。
病情指数 = [?(各级病叶数 × 各级代表值)/(调查总叶数 × 最高级代表值)] × 100。
诱导抗病效果(%)=(对照病情指数–处理病情指数)/对照病情指数 × 100。
1.4 数据统计与分析
试验数据采用 DPS v7.05 软件进行统计分析,并通过邓肯氏新复极差法进行差异显著性分析。