百合花瓣抗氧化酶系统对干旱胁迫响应的研究
摘 要：以‘诺宾’（Robina）、‘索蚌’（Sorbonne）、‘西伯利亚’（Siberia）3 个云南产量较大的观赏百合品种切花为试验材料，研究了干旱胁迫对花瓣相对含水量、可溶性蛋白和丙二醛含量、抗氧化酶活性和抗氧化酶相关基因表达量的影响，并采用隶属函数法对其抗旱性进行了综合评价。
结果表明：随着干旱胁迫增强，花瓣相对含水量和可溶性蛋白含量下降，而代表膜质过氧化程度的丙二醛（MDA）含量持续上升。干旱胁迫下花瓣的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽还原酶（GR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性在处理的前期、中期持续上升，后期下降，说明前中期有较高的活性氧（ROS）清除能力，之后抗氧化能力下降；抗氧化酶基因 Cu-Zn SOD、Mn SOD、CAT、APX 和 GR 的表达先升后降，而 Fe-SOD 的表达一直下降，POD 则一直保持升高的趋势。根据隶属函数平均值大小百合品种抗旱性由强到弱为：‘索蚌’>‘诺宾’>‘西伯利亚’。
干旱胁迫是植物经常遭受的主要环境胁迫之一（邓振镛 等，2008）。由干旱引起的氧化胁迫，通过活性氧对膜系统损伤而对植物造成伤害。但植物在长期进化过程中形成了抵抗氧化胁迫的机制，能通过感受刺激和传导信号，进而启动各种生理生化反应响应干旱胁迫（郝敬虹 等，2012）。
以超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶类组成的酶促清除系统在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用，它们协同作用可清除由干旱胁迫形成的大量活性氧，进而抑制膜脂过氧化反应，使代谢活动正常进行，增强植株的抗旱能力（Ahang & Kirkhan，1994）。
百合是优良的切花品种，但是鲜切花离体后极易萎蔫（邱家德，2016）。目前对百合胁迫处理后抗氧化酶活性变化的研究还不全面，这些研究主要集中在温度和外源植物生长调节剂等胁迫处理后对其单个品种植株或鳞茎中抗氧化酶活性的影响（尹慧 等，2007；师桂英 等，2010），均未全面阐述干旱胁迫对百合抗氧化酶系统的影响及其响应胁迫的协调方式，并且缺乏对云南当地主产百合品种的研究。
本研究中选取云南产量较大的 3 个百合品种为试验材料，研究干旱处理后鲜切花抗氧化酶系统及膜脂过氧化物的变化规律，以期探讨干旱诱导的氧化伤害和植物适应性与抗氧化酶系统之间的关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试验设计
供试材料为温室种植的 3 个百合（Lilium brownii var. viridulum）品种‘诺宾’（Robina）、‘索蚌’（Sorbonne）、‘西伯利亚’（Siberia）。2017 年 5 月收割正常生长的百合，在距花蕾 1 m 处进行切割，刚收获的鲜花插入装有蒸馏水的容器中，在 2 h 内带回实验室进行预处理。在蒸馏水中修剪花枝长度为 30 cm，为 2 ~ 3 片叶。挑选花蕾直径和大小一致的花枝插入蒸馏水中以适应室内环境，取同天同时开放的百合作为试验材料。
试验设干旱组（百合置于空的 500 m L 锥形瓶中持续干旱胁迫处理，直至试验结束）和正常补水对照组（百合置于装有蒸馏水的 500 m L 锥形瓶中）；分组后放入光照培养箱中（昼温 22 ℃/夜温17 ℃，光照 16 h/黑暗 8 h，相对湿度控制为 60%左右）；每隔 24 h 取样 1 次，样品迅速置于液氮中，然后于–80 ℃超低温冰箱保存，以备测定 3 种百合花瓣的各生理生化和分子指标。
1.2 测定项目与测定方法
1.2.1 相对含水量
参照高俊凤（2006）的方法测定。1、剪取花瓣样品迅速称出鲜样质量（Wf）。2、将花瓣样品放入已升温至 105 ℃的烘箱中 15 min，然后于 80 ℃下烘干，称出干样质量（Wd）。3、在称鲜样质量后，将样品浸入蒸馏水中或包裹在吸饱水分的湿纱布中 6 ~ 8 h，取出用吸水纸擦干样品表面水分，
称质量；再次将材料放入水中浸泡一段时间后取出，吸干表面水分，称质量，直到两次的结果基本相等，最后的结果即为饱和鲜样质量（WT）。百合花瓣相对含水量（RWC）指组织含水量占饱和含水量百分数：RWC =（Wf–Wd）/（Wt–Wd）× 100。每次测定重复 3 次。
1.2.2 MDA 以及抗氧化酶活性
MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法（赵世杰 等，1994）；可溶性蛋白质（SPC）含量测定采用考马斯亮蓝 G-250 染色法；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚（二甲氧基酚）法；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）法；过氧化氢酶 CAT 活性按李合生（2000）的方法测定；抗坏血酸过氧化物酶 APX 活性根据 Nakano 和 Asada（1981）的方法测定；谷胱甘肽还原酶 GR 活性按照 Grace 和 Logan（1996）的方法测定。测定均重复 3 次。
1.2.3 基因表达分析
用实时荧光定量 PCR（q PCR）进行基因表达定量分析。各材料 RNA 用 Trizol 提取，c DNA 合成用 Prime scriptTM RT reagent Kit with g DNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒。荧光定量 PCR 用SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNase H Plus）试剂盒，在罗氏 Light Cycler 480 系统上进行，定量引物序列如表 1。每个材料做 3 次独立重复，采用 2-ΔΔCT方法分析处理数据（Livak & Schmittgen，2001）。
1.3 数据分
试验数据采用 SPSS13.0 进行方差分析，邓肯氏新复极差法进行差异显著性检测。利用 Excel 2007进行作图。采用模糊数学隶属函数法对数据进行分析，以确定各指标对百合耐旱性影响的程度，评价其抗旱性。
