多肉植物培养中外植体的消毒是首要步骤

 

4.1外植体消毒

 

多肉植物组织培养中外植体的消毒是首要步骤，直接关系到组织培养的成败与否。在组织培养过程中，所培养的植物必须在无菌的条件下进行，被菌污染后，菌的大量繁殖会与外植体争抢培养基中的养分；其次，菌在生长过程中大多会释放出大量的代谢产物，抑制植物生长；更重要的是，接种的外植体的伤口极易成为菌侵入处植体内部的大门，导致其腐烂死亡[69]。

 

 

一般认为，除部分植物易染内生菌外，健康的植物的地上部分是不带菌的，所以在接种前对外植体的表面消毒是十分重要的。消毒剂在杀灭外植体表面微生物的同时，对植物本身也是有伤害的[70]。本试验中，外植体的污染率随消毒时间的延长而降低，但消毒时间达到一定程度后，外植体的死亡率则升高，这与纪小楠[11]在山核桃的组织培养中研究结果一致。从我们选取的两种外植体可以看出，不同的材料对消毒剂的耐受能力是不同的。

 

玉露叶片表面光滑有革质，消毒剂不易渗透至组织内部，所以适合多种消毒剂配合并保持较长时间的处理；而花葶其本身较为细嫩，且表面带菌量少，适宜使用强消毒剂短时间消毒或较温和的消毒剂。

 

4.2初代培养

 

试验分别采用叶片、花葶为外植体进行培养。花葶采用直接器官发生的方式进行培养，最佳的激素浓度为6-BA2.5mg/L、NAA1.0mg/L的组合。在不添加6-BA的情况下，花葶的诱导率极低，且在添加6-BA后，分化率随其添加浓度的升高而增加，说明分裂素对芽的形成有很大的促进作用，但超过最佳浓度后，芽的分化率呈显著下降趋势，这与Bairu等[71]在多叶芦荟组织培养中的研究结果一致。

 

我们选择了NAA与IBA两种生长素与6-BA配合使用。试验结果显示，NAA更有利于玉露的不定芽诱导，可能因为NAA的活性较IBA要强，花葶不定芽的诱导需要较强的生长素刺激。我们发现相同浓度的NAA条件下，诱导率一般随6-BA的浓度升高而增加；同样，在相同浓度的6-BA条件下，诱导率也一般随生长素的浓度升高而增加。

 

因此，6-BA与NAA、IBA之间对不定芽的诱导存在协同作用。叶片采用间接器官发生的方式进行培养。诱导培养的各个处理都能够使叶片产生愈伤组织，且诱导频率都较高。愈伤组织量大、生长迅速，为后期的分化培养提供了大量的材料，相比于花葶而言，这种方式更适合于工厂化生产。在各激素配比试验中，采用2,4-D诱导产生的愈伤组织生长最差，这可能是其活性太强，且长期使用会对植物产生一定的毒害作用。

 

4.3继代培养

 

多肉植物在培养基中生长一段时间后，培养基内的养分、水分会有大量消耗，或为了进行下一步的培养，所以必须及时更换培养基。为了进行分化培养而继代时，一般会降低激素的使用比例，激素的长期大量使用会对植物产生伤害。比如高浓度的生长素植物容易发生愈伤化和褐化现象，而高浓度的分裂素容易产生玻璃化现象。

 

在玉露愈伤组织分化阶段，当NAA或IAA浓度高于1.0mg/L时，幼苗分化量减少，分化产生的芽点双重新变为了愈伤组织；当6-BA浓度高于1.0mg/L时，几乎所有的处理都发生了玻璃化现象。韩义等[72]在文冠果组织培养研究中发现，随细胞分裂素的增加，组培苗玻璃化现象加重。李琼洁等[73]研究认为，降低6-BA浓度、提高琼脂用量可在一定程度上使玻璃化的洋桔梗苗恢复正常。这些都与本研究结果一致。

 

4.4生根培养

 

以器官发生途径诱导再生植株，一般是先诱导芽再诱导根。根的诱导多选用低无机盐的培养基添加少量的生长素即可完成[74]。试验中，采用1/2MS和WPM基本培养基进行诱导生根，两种基本培养基的差异不大，1/2MS稍优于WPM培养基。使用NAA诱导产生的根粗壮，但基部会产生少量愈伤；使用IBA进行诱导虽较NAA诱导的根要细长，但生长十分健壮。试验过程中发现，长期不断地继代，幼苗生根会越来越困难，这可能是由于长期继代后，6-BA会累积于植物体内，而6-BA具有抑制生根的作用，造成幼苗生根困难。