植物组织培养技术，具有人为控制培养条件，生长周期短、繁殖率高，经济效益高等优点，可用于多肉植物的繁殖。近年来，多肉植物的组织培养相关研究报道的有景天科的劳尔、褐斑伽蓝，百合科的西山寿，日光兰科的水晶掌等［４－６］，但尚未见大和锦组组织培养再生体系研究相关报道。
多肉植物不同种类、品种间对于培养基的要求差异较大，本研究以多肉植物大和锦叶片为外植体，研究不同消毒方式、植物生长激素配比对大和锦愈伤组织诱导、分化过程的影响，以期为大和锦的生物学研究及推广利用提供参考依据及技术支撑。
１ 材料与方法
１．１ 材料供试
材料为大和锦，选取大和锦叶片为外植体（图１），采自于齐齐哈尔大学生命科学与农林学院植物培养室中。
２ 方法
１．２．１ 培养基的配置 采用ＭＳ培养基为基本培养基，ｐＨ为５．８～６．０，煮沸后分装到锥形瓶，放入灭菌锅１２１℃，灭菌２０ｍｉｎ。
１．２．２ 外植体的消毒 为了选择较为适宜的消毒方式，本试验通过对消毒时间和消毒试剂的调整，观察其对污染率的影响。配制出基本ＭＳ培养基，采用１０组不同的消毒方式进行消毒（表１），接种后每隔５ｄ观察并记录，培养４０ｄ后统计污染率，污染率（％）＝污染数／接种数×１００，重复５次，选择出最适宜的消毒方式。
１．２．３ 愈伤组织诱导条件的筛选 将无菌的大和锦叶片切分成４瓣，分别接种于不同配方培养基上诱导萌芽，诱导培养基以ＭＳ为基本培养基，加入不同浓度的６－ＢＡ、ＮＡＡ、ＫＴ，采用正交法进行了三因素三水平试验筛选。
将消毒好的叶片接种于上述培养基中。每瓶接种２个叶片，设１５次重复。观察愈伤组织的生长情况并记录，计算每个处理组合下愈伤组织的诱导率，并拍摄照片。愈伤组织诱导率（％）＝（愈伤组织数／总植物叶片数）×１００。１．２．４ 数据分析 采用Ｅｘｃｅｌ ２００７进行数据处理和统计分析。
２ 结果与分析
１ 不同消毒处理
对大和锦愈伤组织诱导的影响 在ＭＳ基本培养基上进行接种，接种７ｄ后观察污染率、叶片的颜色以及叶片的生长状况，由表１可知，随着ＮａＣｌＯ消毒时间的增长，污染率逐渐降低，但是第５组７５％乙醇３０ｓ＋１％ＮａＣｌＯ ２０ｍｉｎ会导致叶片发黑、生长状况不佳即叶片死亡；随着酒精的消毒时间增长，污染率降低，但是叶片的生长状况不如７５％酒精３０ｓ的生长状况良好，而且第８组７５％乙醇４０ｓ＋１％ＮａＣｌＯ １７ｍｉｎ也出现了叶片死亡。综上所述，得到最佳消毒叶片的消毒方式为７５％乙醇３０ｓ＋１％ＮａＣｌＯ １７ｍｉｎ污染率最低，为１０．００％.
３ 讨论与结论
植物组织培养通过无菌操作可快速便捷的获得再生的完整植株［７－８］，多肉植物其植株肥厚多汁、形状多样，实际操作中对多肉植物外植体材料需要进行严密的消毒处理，以便获得无菌的愈伤组织。
外植体的消毒过程应该进行有效的筛选，不同的消毒处理对外植体产生的效果不同，不当的消毒方法有可能造成外植体表面的微生物未彻底杀死导致其污染率得不到有效控制，若消毒时间过多，不仅外植体表面微生物彻底杀死，也会影响外植体自身的细胞活性，使外植体失去活力不能诱导产生愈伤组织。
本研究中针对外植体消毒方法进行了有效筛选，最终７５％乙醇浸泡３０ｓ、１％ＮａＣｌＯ浸泡１７ｍｉｎ处理后，污染率得到有效的控制，外植体活力也较好。研究洋甘菊［９］的外植体消毒发现污染率与外植体活力受５％ＮａＣｌＯ的消毒时间的影响，延长消毒时间会造成组织细胞被杀死，严重影响诱导率，这与本研究消毒处理筛选结果相似。植物生理生化过程受到生长调节物质的调控影响，其中生长素和细胞分裂素两类激素起主要作用，不同的激素配比对愈伤组织的诱导与分化结果影响显著［１０－１３］。
在激素及其配比方面，本研究表明ＭＳ＋３．０ｍｇ·Ｌ－１ ６－ＢＡ＋０．１ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ＋１．０ｍｇ·Ｌ－１ ＫＴ，获得的愈伤组织质量最佳，其中仅６－ＢＡ和ＮＡＡ配比时出愈率较低，含有适宜配比的６－ＢＡ、ＮＡＡ、ＫＴ培养基有利于愈伤组织的形成，这与多肉植物劳尔、克里克特寿、美吉寿、寿锦等叶片诱导愈伤组织研究结果一致［１４－１５］。
本研究６－ＢＡ和ＮＡＡ对大和锦愈伤组织分化芽的效果显著，当６－ＢＡ浓度一定时分化率随着ＮＡＡ浓度增加而增加，ＮＡＡ浓度的增加有助于分化出新芽，最佳的分化培养基为ＭＳ＋３．０ｍｇ·Ｌ－１６－ＢＡ＋０．２ｍｇ·Ｌ－１ ＮＡＡ。本研究利用大和锦叶片为外植体诱导产生大量愈伤组织，愈伤组织再分化形成新芽，得到大量再生芽，为后续扩大大和锦无菌植株数量的生产奠定一定理论基础。
