2.1不同植物器官及不同HgCl2消毒时间对外植体成活率的影响
表5显示,随着HgCl2消毒时间的增加,污染率大幅度降低,这说明使用HgCl2处理对材料表面所携带的污染物具有较好的灭杀效果;但是随着HgCl2处理时间的延长,植物成活率明显降低,说明过长时间的HgCl2接触会对白牡丹外植体造成较大伤害。
不同植物器官用HgCl2处理的效果也是不同的,使用茎段作为外植体时,大部分处理成活率要低于以叶片为外植体的处理组,这说明相比茎段,叶片更适宜作为外植体。同时,使用茎段作外植体时,3d后的污染率仍然在不断上升,与15d时相比,各处理的污染率上升幅度均大于以叶片为外植体的处理组,这一现象可能与茎段上存在灭菌死角、自身所带的内生菌较多有关,也进一步说明了相比茎段,叶片更适宜作为外植体。综合白牡丹生长特性,由于白牡丹自身生长速度缓慢,难以取得如花茎这类内生菌相对较少的外植体材料,故较适的外植体材料为叶片,最佳消毒处理方法为采用75%乙醇处理15s、0.1%HgCl2处理12min。
2.2不同培养基下无菌苗的诱导培养
表6显示:使用白牡丹叶片为外植体,在合适培养基配方下叶片即可以直接诱导出大量丛生芽。在试验中发现,NAA与6-BA含量比值与丛生芽的发生有密切关联,6-BA含量范围为1~3mg/L时,当6-BA/NAA值<10,则大部分叶片开始只生根不长芽,最终叶片死亡;当6-BA/NAA>10时,大部分叶片逐渐开始发生膨大,最终形成水渍状的愈伤组织;6-BA/NAA值=10时,丛生芽诱导效果最好。
当6-BA含量为2mg/L、NAA含量为0.2mg/L时,白牡丹丛生芽诱导效果最好,在灭菌接种约8d时,叶片首先出现一定膨大,部分区域发生开裂,可见内部嫩绿色膨大组织;之后15d左右时,在近基部的叶片区域以及叶片开裂的区域内,萌发出大量丛生芽,丛生芽平均萌发量达10.8芽/张,诱导效果良好。
2.3不同培养基下无菌苗的增殖培养
由表7可见,第3组处理2mg/L6-BA+2mg/LKT的增殖倍数最高,但增殖长势最差,出现了严重的玻璃化现象,导致之后无法正常继代生长,故此配方不具备可行性;而在第1组不添加激素的培养基中,丛生芽长势最好,说明此培养基适合作为白牡丹的壮苗培养基使用,在出现丛生芽长势变差需要壮苗生根时,可选用此配方。
综合各组增殖倍数以及长势来看,第9组0.2mg/LNAA+2mg/L6-BA+1mg/LKT为最佳增殖培养基处理,在此激素组合下丛生芽有较高的增殖倍数,在长势上也较为良好,利于转接继代。
由表8可以看出,KT、6-BA在0.05水平下影响显著,说明这2种激素在丛生芽增殖时与增殖倍数有着较大相关性,而KT影响度相较于6-BA更大,说明KT对于白牡丹丛生芽的增殖倍数较6-BA更为敏感。NAA对丛生芽增殖倍数影响较小,结合丛生芽增殖长势,NAA含量可能与维持丛生芽正常形态有关,通过配合NAA的添加,使得丛生芽在高速增殖的同时仍然保持一定的正常长势,避免出现玻璃化现象。
2.4炼苗移栽
白牡丹的炼苗与常规组培苗炼苗区别较大。首先,组培苗所产生的根系在炼苗过程中难以存活,这表明在白牡丹快繁过程中不宜进行瓶内生根。此外,在白牡丹的炼苗过程中进行保湿处理并不利于其生长,而相对干燥的环境更加利于白牡丹新根的萌发及存活。组培苗切根后移栽于保持湿润的介质中,大部分植株在8d左右时切口处即发生溃烂,导致植株死亡。由表9可见,带根的组培苗在保持湿润的介质中始终无明显变化,30d内未见新根形成,且有部分组培苗出现溃烂死亡。
带根的组培苗移栽于干燥介质中,虽然根系很快出现死亡,植株出现了萎蔫现象,但大部分植株在25d左右后即出现了新根并存活下来,只有少部分植株死亡。将组培苗切根后移栽入保持干燥的介质中,相比以上几组植株成活情况好,植株移栽后在12d时即见新根产生,炼苗成活率可达95%。
3结论与讨论
不同多肉植物,根据自身特性的不同,可以用不同的诱导方式以及增殖手法来进行组培扩繁。在实际操作中,需要视无菌苗生长情况进行科学选择,如大和锦、玉露、十二卷、寿等这些多肉,首先需要通过诱导形成绿色球状小体或愈伤组织,再来诱导产生丛生芽[2]。本试验中的白牡丹,在对叶片进行诱导时直接就可以诱导出丛生芽,通过对丛生芽的增殖培养,即可获得高效增殖扩繁体系,若对其进行愈伤诱导培养反而影响了其增殖进程,没有太大意义。
在增殖培养中,经过方差分析发现,白牡丹丛生芽增殖倍数与KT、6-BA显著相关,而NAA虽然与增殖倍数无显著相关,但与丛生芽形态关联密切,丛生芽在NAA与KT、6-BA组合下达到最优繁殖水平,这与宋晓涛等的研究结论[3-4]基本一致,但夏时云等在对龟甲龙的增殖培养中,使用NAA与KT的组合配方也取得良好繁殖[5]。同时,本研究中KT与增殖倍数的相关性较6-BA高,这说明有可能仅使用KT的效果也会较好,这还有待进行验证。在对多肉植物的炼苗过程中,常规的保湿条件并不利于多肉的炼苗与移栽。
在相对干燥的情况下,白牡丹植株不但没有出现萎蔫枯死的现象,反而有利于新根的萌发,这与多肉植物平时的养护种植有一定类似[6],在常规繁殖中,也是相对干燥的环境更有利于根系产生及植株生长,这可能是由多肉植物原本的生境以及自身的一些特性所决定的,具体是哪些因素造成的,也有待进一步研究。